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文献解读 |在体内通过CRISPR/Cas9介导表观遗传调控激活靶基因
科技服务 2016-12-07

文章来源:

2017年12月发表于《Cell》   IF: 30.41

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前言


在一项新的研究中,来自美国沙克生物研究所的研究人员开发出CRISPR/Cas9基因组编辑技术的一种新版本,从而允许他们激活靶基因,同时不会导致DNA断裂,这就潜在地克服了利用基因编辑技术治疗人类疾病的一个重大的障碍,下面就跟随着小编一起来学习下这篇文章吧。


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背景知识


在过去的30年里,表观遗传疗法已被用于治疗多种人类疾病,包括癌症、糖尿病、自身免疫、遗传疾病。多数方法都是依赖药物,这些药物可以很大程度上改变表观遗传标记(例如:DNA 甲基化和组蛋白修饰),但药物疗法是存在风险的,而且也可能会影响非目的基因。

基因编辑技术的进步打开了广泛的科学领域研究,从基础科学到转化医学。特别是,细菌的免疫系统(CRISPR / Cas9的出现),提供了一种快速、高效、RNA介导的位点特异的基因编辑方法。大多数CRISPR/Cas9系统会在靶向编辑或删除的基因组区域中产生“双链断裂(double-strand break, DSB)”,但这也限制了其在临床治疗上的应用,因为DSBs可能会造成不必要的突变而对细胞产生不良影响。CRISPR / Cas9系统近来被用于旨在不切割双链的情况下激活目标基因,调节内源基因的表达,但要在体内实现是很困难的。


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解读专栏


01 研究思路

相比较于传统方法(单或多转录激活结构域融合蛋白法)存在一些局限性,如:1)融合蛋白不易进入体内;2)dCas9/gRNA和协同转录激活复合物的编码序列超出了通用病毒载体的容量(AAV) 。

通过筛选大量的组合,他们找到了一种无需将分子开关与Cas9蛋白(无论失活还是不失活)融合在一起,就能起作用的方法。将Cas9或dCas9包装到一种AVV载体中,将TAD和dgRNA包装到另一种AAV载体中。研究人员还对gRNA进行优化以便确保所有的这些组分最终出现在基因组的合适位点上。为了验证这种方法,研究人员使用了急性肾损伤、1型糖尿病和一种肌肉萎缩症的小鼠模型。文章具体思路如下图所示:

改进后的CRISPR/Cas9TGA system可以在体内在不引起基因双链断裂的情况下调节 生理相关表型。

CRISPR/Cas9和共转录激活复合物共同作用,可广泛用于:

(1)恢复基因表达水平(例如:在急性肾损伤后或mdx模型中恢复klotho水平)

(2)弥补遗传缺陷(例如:过表达相似编码蛋白来弥补抗肌萎缩蛋白的缺失)

(3)通过诱导分化转移因子改变细胞命运(例如:诱导Pdx1表达产生分泌胰岛素细胞 )

02 研究过程

1、优化CRISPR/Cas9 system 促进靶基因激活(CRISPR/Cas9 TGA System)

研究人员先是构建了最优化的CRISPR/Cas9system用于激活靶基因,图A中14bp截短的dgRNA(dead sgRNA)连接2个MS2茎环结构(用于结合转录激活复合物MS2-P65-HSF1,MPH)构建到AAV载体中,导入表达Cas9的小鼠中,由此形成的转录激活物分子可以强烈地激活靶基因;为了验证此系统的活性,图B为研究人员构建的荧光素酶报告基因载体;图D、E、F验证了图C中14bp-TCAG-MS2-dgRNA活性最高;图F、G表示将dgRNA 载体和荧光素酶报告基因载体通过肌肉注射注射到小鼠体内,第9天通过荧光素酶成像观察到小鼠体内荧光素蛋白的表达。由此证明,研究人员优化的CRISPR/Cas9 system 可以用于激活靶基因。


2、AAV介导的CRISPR/Cas9 TGA System可在小鼠不同组织中激活报告基因

为了进一步验证该系统的活性,研究人员通过不同的注射方法(肌肉注射、头部注射、面静脉注射、尾静脉注射)将表达dgRNA和荧光素酶报告基因的载体导入小鼠体内,均能在小鼠组织中观察到荧光素酶的表达。



3、CRISPR/Cas9TGA system 能诱导内源基因表达

以上实验证明了CRISPR/Cas9 TGA  system可以诱导外源基因的表达,为了研究其对内源基因的作用,研究人员用这套系统作用于Fst 基因,其表达上调。


研究人员在Fst基因转录起始位点两端各设计1条dgRNA,经体外实验分析2条dgRNA活性都较高;图B、C表示将dgRNA通过后侧肌肉注射到新生小鼠(p2.5)体内,在p25、3mouth 时Fst基因表达明显上调;图D、E通过肉眼观察小鼠后腿肌肉有明显改善;图F表中小鼠胫骨前肌、股四头肌重量都有所增加;图G、H中小鼠肌纤维变大;图J是小鼠握力测试,因为是通过小鼠后侧肌肉注射,因此后侧肌肉有明显改善,前侧肌肉基本无变化。


4、CRISPR/Cas9 TGA 诱导内源基因表达可以改善急性肾损伤表型

TL-10、klotho 是两个已知参与肾脏功能的基因,研究人员利用他们的CRISPR/Cas9系统激活这两个基因的表达,观察到不仅这些基因表达的蛋白水平发生增加,而且这会改善急性肾脏损伤发生之后的肾脏功能,肾损伤之后的一些病理特征也都有明显下降。


图G中小鼠大剂量注射顺铂药物后,诱导Klotho表达明显延长了小鼠寿命。


5、CRISPR/Cas9 TGA 可以介导体内细胞的转分化

Pdx1是与胰腺发育有关的基因,可以介导肝细胞向分泌胰岛素β样细胞转分化,研究人员利用他们的系统激活该基因,观察到Pdx1、insulin1、insulin2、Pcsk1这些蛋白的表达增加,也成功地降低了1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。



另外,该系统不仅可以激活单个基因,也可以同时激活多个基因。


6、CRISPR/Cas9 TGA激活Klotho和Utrophin内源基因可以部分缓解肌营养不良小鼠症状

1)研究人员利用他们的系统让已经证实过逆转疾病症状的基因Klotho表达,可以缓解肌肉萎缩


2)Utrophin和dystrophin编码序列高度相似,通过诱导Utrophin基因表达可

以改善因dystrophin基因缺陷所造成的疾病症状。


7、双重AAV系统(包括AAV-Cas9)改善肌营养不良表型

在表达Cas9的小鼠中研究人员利用他们的系统可以用于治疗一些疾病类型,为了进一步阐述其应用,研究人员将该系统与表达Cas9的AAV载体共用,也成功改善肌营养不良小鼠表型。


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研究意义


1、文中描述的优化后的CRISPR/Cas9TGA system 可以在体内激活内源基因的表达,不仅可以激活单基因,也可以同时激活多个基因,包括特别大的一些基因;

2、该系统可以通过诱导相似基因表达来弥补功能基因的缺失突变,可过表达长链非编码RNA或GC-rich 基因来揭露其生物学功能,也可以用来研究基因之间的相互关系。

3、未来通过提高其特异性(如使用组织特异的启动子或具有侵向性的AAV载体)可以为一些人类疾病提供一种有效的治疗手段。


以上就是文章《In Vivo Target Gene Activationvia CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation》的全部内容啦,若有疑问欢迎随时咨询!我们下期文献详解再见!




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